Жылан уының құрамында карбоксил эфир байланыстарын гидролиздейтін ферменттер бар.Гидролиздің субстраттары фосфолипидтер, ацетилхолин және ароматты ацетат.Бұл ферменттердің үш түрі бар: фосфолипаза, ацетилхолинэстераза және ароматты эстераза.Жылан удың құрамындағы аргинин эстеразасы синтетикалық аргининді немесе лизинді де гидролиздей алады, бірақ ол негізінен табиғаттағы ақуыздық пептидтік байланыстарды гидролиздейді, сондықтан ол протеазаға жатады.Мұнда талқыланатын ферменттер эфир субстраттарына ғана әсер етеді және ешқандай пептидтік байланысқа әсер ете алмайды.Бұл ферменттердің ішінде ацетилхолинэстераза мен фосфолипазаның биологиялық қызметтері маңыздырақ және олар толық зерттелген.Кейбір жылан уларының күшті ароматты эстеразалық белсенділігі бар, олар p-нитрофенил этил эфирін, a – немесе P-нафталин ацетатын және индол этил эфирін гидролиздей алады.Бұл белсенділіктің биологиялық маңызын былай қойғанда, тәуелсіз фермент немесе карбоксилэстеразаның белгілі жанама әсері шығаратыны әлі белгісіз.Agkistrodon halys Japonicus уы р-нитрофенил этил эфирімен және индол этил эфирімен әрекеттескенде p-нитрофенол мен индол фенолдың гидролизаттары табылмады;Керісінше, егер бұл күрделі эфирлер кобра Жоушан түршесінің жылан уы және Bungarus multicinctus жылан уымен әрекеттессе, олар тез гидролизденеді.Бұл кобра уларының жоғарыда көрсетілген субстраттардың гидролизіне жауапты болуы мүмкін күшті холинэстераза белсенділігі бар екені белгілі.Шын мәнінде, Mclean et al.(1971) Кобра тұқымдасына жататын көптеген жылан улары индол этил эфирін, нафталин этил эфирін және бутил нафталин эфирін гидролиздей алатынын хабарлады.Бұл жыланның улары: кобра, қара мойын кобра, қара ерінді кобра, алтын кобра, мысыр кобра, король кобра, алтын кобра мамба, қара мамба және ақ ерінді мамбадан (Д. ав әлі күнге дейін шығыс ромбола шұбар жыланды біледі)
Жылан уы қан сарысуындағы холинэстераза белсенділігін анықтауға арналған субстрат болып табылатын метилиндол этил эфирін гидролиздей алады, бірақ бұл жылан уы холинэстераза белсенділігін көрсетпейді.Бұл кобраның уында холинэстеразадан ерекшеленетін белгісіз эстеразаның бар екенін көрсетеді.Бұл ферменттің табиғатын түсіну үшін одан әрі бөлу жұмыстары қажет.
1, фосфолипаза A2
(I) Шолу
Фосфолипаза - глицеринфосфатты гидролиздей алатын фермент.Табиғатта фосфолипазаның 5 түрі бар: фосфолипаза А2 және фосфолипаза
A. , фосфолипаза В, фосфолипаза С және фосфолипаза D. Жылан уының құрамында негізінен фосфолипаза A2 (PLA2), бірнеше жылан уларында фосфолипаза В, ал басқа фосфолипазалар негізінен жануарлардың ұлпаларында және бактерияларында кездеседі.3-11-4-суретте бұл фосфолипазалардың субстрат гидролизіне әсер ету орны көрсетілген.
Фосфолипазалардың ішінде PLA2 көбірек зерттелген.Бұл жылан уындағы ең көп зерттелген фермент болуы мүмкін.Оның субстраты Sn-3-глицерофосфаттың екінші позициясындағы күрделі эфирлік байланыс болып табылады.Бұл фермент жылан уы, ара уы, шаян уы және жануарлар тіндерінде кеңінен кездеседі, ал PLA2 төрт отбасылық жылан уларында көп.Бұл фермент қызыл қан жасушаларын бұзып, гемолизді тудыратындықтан, оны «гемолизин» деп те атайды.Кейбір адамдар PLA2 гемолитикалық лецитиназа деп те атайды.
Людике алғаш рет жылан уы ферменттер арқылы лецитинге әсер ету арқылы гемолитикалық қосылыс түзе алатынын анықтады.Кейінірек Делезен және т.б.кобра уы жылқы сарысуына немесе сарысына әсер еткенде гемолиздік зат түзетінін дәлелдеді.Қазіргі уақытта PLA2 эритроцит мембранасының фосфолипидтеріне тікелей әсер етіп, эритроцит мембранасының құрылымын бұзып, тікелей гемолизді тудыруы мүмкін екендігі белгілі;Ол сондай-ақ сарысуға әсер ете алады немесе жанама гемолиз жасау үшін қызыл қан жасушаларына әсер ететін гемолитикалық лецитинді өндіру үшін лецитинді қоса алады.PLA2 жылан уларының төрт тұқымдастығында көп болғанымен, әртүрлі жылан уларындағы ферменттердің мазмұны сәл өзгеше.Шылдырлы жылан (C
Жылан уы тек әлсіз PLA2 белсенділігін көрсетті.3-11-11-кесте Қытайдағы улы жыландардың 10 негізгі уларының PLA2 белсенділігін салыстыруды көрсетеді.
Кесте 3-11-11 Қытайдағы 10 жылан уының фосфолипаза VIII белсенділігін салыстыру
Жылан уы
Майдың бөлінуі
Алифат қышқылы,
Цжумол/мг)
Гемолитикалық белсенділік CHU50/^ г * мл)
Жылан уы
Май қышқылдарын босатыңыз
(^раол/мг)
Гемолитикалық белсенділік «(HU50/фут * 1111)
Наджанажа атра
9. 62
он бір
Микрацефальды офис
бес ұпай бір нөл
калыспалла
8. 68
екі мың сегіз жүз
gracilis
V, өткір
7. 56
* * #
Офиофаг Ханна
үш ұпай сегіз екі
жүз қырық
Bnugarus fasctatus
7,56
екі жүз сексен
B. multicinctus
бір ұпай тоғыз алты
екі жүз сексен
Жылан және Руссель
жеті ұпай нөл үш
T, шырышты қабық
бір ұпай сегіз бес
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Бөлу және тазарту
Жылан удың құрамындағы PLA2 мөлшері үлкен және ол қыздыруға, қышқылға, сілтіге және денатурантқа тұрақты, сондықтан оны тазарту және PLA2 бөлу оңай.Жалпы әдіс - алдымен шикі уға гельді фильтрациялау, содан кейін ион алмасу хроматографиясын жүргізу және келесі қадамды қайталауға болады.Айта кету керек, ион алмастырғыш хроматографиядан кейін PLA2 мұздату арқылы кептіру агрегацияны тудырмауы керек, өйткені мұздату арқылы кептіру процесі жүйедегі иондық күшті арттырады, бұл PLA2 агрегациясын тудыратын маңызды фактор болып табылады.Жоғарыда аталған жалпы әдістерге қосымша келесі әдістер де қабылданды: ① Wells et al.② PLA2 субстрат аналогы ұқсастық хроматографиясы үшін лиганд ретінде пайдаланылды.Бұл лиганд Ca2+ бар жылан уындағы PLA2-мен байланыса алады.EDTA көбінесе элюент ретінде қолданылады.Са2+ жойылғаннан кейін PLA2 мен лиганд арасындағы аффинділік төмендейді және ол лигандадан диссоциациялануы мүмкін.Басқалары элюент ретінде 30% органикалық ерітінді немесе 6 моль/л мочевина пайдаланады.③ Кардиотоксиндегі PLA2 ізін жою үшін PheiilSephar0SeCL-4B көмегімен гидрофобты хроматография жасалды.④ Anti PLA2 антиденесі PLA2-де ұқсастық хроматографиясын орындау үшін лиганд ретінде пайдаланылды.
Осы уақытқа дейін көптеген жылан уы PLAZ тазартылды.Ту және т.б.(1977) 1975 жылға дейін жылан уынан тазартылған PLA2 тізімін жасады. Соңғы жылдары жыл сайын PLA2 бөлу және тазарту туралы көптеген мақалалар хабарланды.Мұнда біз қытай ғалымдарының PLA-ны бөлуге және тазартуға назар аударамыз.
Чен Юанконг және т.б.(1981) Чжэцзяндағы Agkistrodon halys Pallas уынан PLA2 үш түрін бөлді, оларды изоэлектрлік нүктелері бойынша қышқылды, бейтарап және сілтілі PLA2 деп бөлуге болады.Уыттылығына сәйкес бейтарап PLA2 улырақ болып табылады, ол пресинаптикалық нейротоксин Agkistrodotoxin ретінде анықталған.Сілтілік PLA2 аз уытты, ал қышқылды PLA2 уыттылығы дерлік жоқ.Ву Сянфу т.б.(1984) үш PLA2 сипаттамаларын салыстырды, оның ішінде молекулалық масса, амин қышқылы құрамы, N-терминал, изоэлектрлік нүкте, термиялық тұрақтылық, ферменттердің белсенділігі, уыттылық және гемолитикалық белсенділік.Нәтижелер олардың молекулалық салмағы мен термиялық тұрақтылығының ұқсас екенін, бірақ басқа аспектілерде айтарлықтай айырмашылықтары бар екенін көрсетті.Ферменттік белсенділік аспектісінде қышқылдық ферменттердің белсенділігі сілтілі ферменттердің белсенділігінен жоғары болды;Егеуқұйрықтың эритроциттеріне сілтілі ферменттің гемолитикалық әсері ең күшті болды, одан кейін бейтарап фермент болды, ал қышқылдық фермент әрең гемолизденеді.Сондықтан PLAZ гемолитикалық әсері PLA2 молекуласының зарядымен байланысты деген болжам бар.Чжан Цзинкан және т.б.(1981) Агкистродотоксин кристалдарын жасады.Ту Гуанглян және т.б.(1983) изоэлектрлік нүктесі 7.6 болатын улы PLA фуцзяндық Vipera rotundus уынан бөлініп, тазартылғанын және оның физикалық және химиялық қасиеттерін, аминқышқылдарының құрамын және N. - терминал анықталды.Li Yuesheng және т.б.(1985) Фуцзяндағы Viper rotundus уынан басқа PLA2 бөліп, тазартты.PLA2 * суббірлігі 13 800, изоэлектрлік нүктесі 10,4, меншікті белсенділігі 35/xnioI/miri мг。 Лецитин субстрат ретінде болғанда, ферменттің оңтайлы рН мәні 8,0 және оңтайлы температура 65 ° C. LD5 тышқандарға көктамыр ішіне енгізілді.Ол 0,5 ± 0,12 мг/кг құрайды.Бұл ферменттің айқын антикоагулянттық және гемолитикалық әсері бар.Уытты PLA2 молекуласы 18 түрлі аминқышқылдарының 123 қалдығынан тұрады.Молекула цистеинге (14), аспарагин қышқылына (14) және глицинге (12) бай, бірақ тек бір метионин бар, ал оның N-терминалында серин қалдығы бар.Тугуанг бөліп алған PLA2-мен салыстырғанда екі изоферменттің молекулалық салмағы мен аминқышқылдары қалдықтарының саны өте ұқсас, аминқышқылдарының құрамы да өте ұқсас, бірақ аспарагин қышқылы мен пролин қалдықтарының саны біршама ерекшеленеді.Гуанси патшасы кобра жыланының уының құрамында PLA2 бай.Шу Юян және т.б.(1989) удан PLA2 бөліп алды, оның өзіндік белсенділігі бастапқы уланға қарағанда 3,6 есе жоғары, молекулалық салмағы 13000, құрамы 122 амин қышқылы қалдықтары, изоэлектрлік нүктесі 8,9 және термиялық тұрақтылығы жақсы.Электрондық микроскоп арқылы негізгі PLA2-нің эритроциттерге әсерін бақылаудан оның эритроциттердің мембранасына айқын әсер ететінін, бірақ ешкі қызыл қан жасушаларына айқын әсер етпейтінін көруге болады.Бұл PLA2 адамдарда, ешкілерде, қояндарда және теңіз шошқаларында қызыл қан жасушаларының электрофоретикалық жылдамдығына айқын баяу әсер етеді.Чен және т.б.Бұл фермент АДФ, коллаген және натрий арахидон қышқылымен туындаған тромбоциттердің агрегациясын тежей алады.PLA2 концентрациясы 10/xg/ml~lOOjug/ml болғанда тромбоциттер агрегациясы толығымен тежеледі.Егер жуылған тромбоциттер материал ретінде пайдаланылса, PLA2 20Мг/мл концентрациясында агрегацияны тежей алмайды.Аспирин тромбоциттерге PLA2 әсерін тежей алатын циклооксигеназаның тежегіші болып табылады.PLA2 тромбоксан А2 синтездеу үшін арахидон қышқылын гидролиздеу арқылы тромбоциттер агрегациясын тежей алады.Чжэцзян провинциясындағы Agkistrodon halys Pallas уы өндірген PLA2 ерітінді конформациясы дөңгелек дихроизм, флуоресценция және ультракүлгін сіңіру арқылы зерттелді.Тәжірибе нәтижелері көрсеткендей, бұл ферменттің негізгі тізбекті конформациясы басқа түрлер мен тектердегі ферменттердің бірдей түріне ұқсас, қаңқа конформациясы жақсы ыстыққа төзімді, ал қышқыл ортадағы құрылымдық өзгеріс қайтымды болды.Са2+ активаторы мен ферменттің қосындысы триптофан қалдықтарының ортасына әсер етпейді, ал Zn2+ ингибиторы керісінше әсер етеді.Ерітіндінің рН мәні ферменттердің белсенділігіне әсер ету жолы жоғарыда аталған реагенттерден өзгеше.
Жылан уын PLA2 тазарту процесінде жылан уының екі немесе одан да көп PLA2 элюция шыңы болуы айқын құбылыс болып табылады.Бұл құбылысты былай түсіндіруге болады: ① изоферменттердің болуына байланысты;② PLA2 бір түрі әртүрлі молекулалық салмақтары бар әртүрлі PLA2 қоспаларына полимерленеді, олардың көпшілігі 9 000~40 000 диапазонында;③ PLA2 және жылан уының басқа компоненттерінің комбинациясы PLA2-ні қиындатады;④ PLA2-дегі амидтік байланыс гидролизденетіндіктен, заряд өзгереді.① Және ② жиі кездеседі, тек бірнеше ерекшеліктерді қоспағанда, CrWa/w жылан уындағы PLA2
Екі жағдай бар: ① және ②.Үшінші жағдай PLA2-де келесі жыландардың уынан табылды: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, Палестина жылан, құм жылан және қорқынышты жылан км.
④ жағдайының нәтижесі электрофорез кезінде PLA2 миграциясының жылдамдығын өзгертеді, бірақ аминқышқылдарының құрамы өзгермейді.Пептидтерді гидролиз арқылы ыдыратуға болады, бірақ әдетте олар әлі де дисульфидтік байланыстармен байланысады.Шығыс шұңқырлы жыланның уының құрамында PLA2-нің екі түрі бар, олар тиісінше a және p PLA2 деп аталады.PLA2-нің осы екі түрінің арасындағы айырмашылық тек бір амин қышқылы, яғни бір PLA2 молекуласындағы глутамин басқа PLA2 молекуласындағы глутамин қышқылымен ауыстырылады.Бұл айырмашылықтың нақты себебі анық болмаса да, әдетте бұл PLA2 дезаминденуімен байланысты деп есептеледі.Палестина жыланының уындағы PLA2 шикі умен жылы ұсталса, оның фермент молекулаларындағы соңғы топтар бұрынғыдан да көп болады.Жылан уынан бөлінген C PLA2 екі түрлі N-терминалға ие және оның молекулалық салмағы 30000. Бұл құбылыс PLA2 асимметриялық димерінен туындауы мүмкін, ол шығыс алмазды жыланның уындағы PLA2 түзетін симметриялық димерге ұқсас. және батыс гауһар тасты жылан.Азиялық кобра көптеген кіші түрлерден тұрады, олардың кейбіреулері жіктелуі бойынша өте нақты емес.Мысалы, бұрын Кобра Сыртқы Каспий кіші түрі деп аталып келгендер қазір танылды
Оны сыртқы Каспий кобрасына жатқызу керек.Көптеген кіші түрлер бар және олар бір-бірімен араласқандықтан, жылан уының құрамы әртүрлі көздерге байланысты айтарлықтай өзгереді, сонымен қатар PLA2 изоферменттерінің мазмұны да жоғары.Мысалы, кобра уы
r ^ ll түрінің кем дегенде 9 түрі PLA2 изоферменттері, ал Каспий кобра түрінің уынан PLA2 изоферменттерінің 7 түрі табылды.Дуркин және т.б.(1981) жыланның 18 уы, 3 мамба уы, 5 жылан уы, 16 жылан уы және 3 теңіз жыланының уын қоса алғанда, жыландардың әртүрлі уларында PLA2 мазмұнын және изозимдердің санын зерттеді.Жалпы алғанда, кобра уының PLA2 белсенділігі жоғары, көптеген изозимдері бар.Жылан уының PLA2 белсенділігі мен изозимдері орташа.Мамба уы мен жылан уының PLA2 белсенділігі өте төмен немесе PLA2 белсенділігі жоқ.Теңіз жыланының уының PLA2 белсенділігі де төмен.
Соңғы жылдары жылан уындағы PLA2 белсенді димер түрінде болатыны хабарланбаған, мысалы, шығыс ромбофора шұбар жылан (C. жылан уының құрамында a және P PLA2 типі бар, олардың екеуі де екі бірдей суббірліктен тұрады. , және тек димераза бар
Белсенділік.Шен және т.б.сонымен қатар жылан уының PLA2 димері ғана ферменттің белсенді түрі болып табылады деп ұсынды.Кеңістіктік құрылымды зерттеу сонымен қатар батыс алмазды жыланның PLA2 димер түрінде болатынын дәлелдейді.Балыққоректі қосылыс
Жылан уының екі түрлі PLA ^ Ei және E2 бар, оларда 仏 димер түрінде болады, димер белсенді, ал оның диссоциацияланған мономері белсенді емес.Лу Инхуа және т.б.(1980) әрі қарай Э.Джаянти және т.б. физикалық және химиялық қасиеттері мен реакция кинетикасын зерттеді.(1989) жылан уынан негізгі PLA2 (VRVPL-V) бөліп алды.PLA2 мономерінің молекулалық салмағы 10000, ол өлімге әкелетін, антикоагулянтты және ісінуді азайтады.Фермент PH 4,8 шартында әртүрлі молекулалық массасы бар полимерлерді полимерлей алады, ал полимерлену дәрежесі және полимерлердің молекулалық массасы температураның жоғарылауымен артады.96°С температурада түзілетін полимердің молекулалық массасы 53100, ал бұл полимердің PLA2 белсенділігі екі есе артады.
Жіберу уақыты: 18 қараша 2022 ж